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通用 SP 试剂盒

通用 SP 试剂盒

品牌:北京中杉

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    存储条件:2~8℃暗处保存。

    检验原理:生物素标记的山羊抗小鼠/兔IgG聚合物与结合在组织片上的一抗反应形成免疫复合物,辣根酶标记链霉卵白素与生物素免疫复合物结合进一步形成聚合物,聚合物上的辣根酶(HRP)催化显色底物(DAB或AEC)形成不溶性色原,从而在显微镜下显示出组织片中的特定抗原的位点。

    试剂盒内容:

    包装规格:3mL6mL18mL55mL110mL
    试剂1:内源性过氧化物酶阻断剂3mL6mL18mL55mL110mL
    试剂2:封闭用正常山羊血清工作液3mL6mL18mL55mL110mL
    试剂3:生物素标记山羊抗小鼠/兔IgG聚合物3mL6mL18mL55mL110mL
    试剂4:辣根酶标记链霉卵白素工作液3mL6mL18mL55mL110mL

    检验方法:

    1、检验所需仪器、设备:移液器、恒温箱、修复仪、免疫组化笔、计时器、孵育盒、染色架、盖玻片、光学显微镜、洗瓶。

    2、试剂准备:DAB显色液需要在使用前配制。 

    3、操作程序: 

    a) 脱蜡和水化

    石蜡切片置于新鲜二甲苯中,浸泡10分钟×3次;去除多余的液体后,置于无水乙醇中,浸泡3分钟×3次;去除多余的液体后,置于95%乙醇中,浸泡3分钟×2次;去除多余的液体后,置于75%乙醇中,浸泡3分钟×2次;蒸馏水冲洗1分钟,置于PBS缓冲液中。

    b) 抗原修复,参见一抗说明书。

    c) 阻断内源性过氧化物酶

    加入适量的内源性过氧化物酶阻断剂,室温孵育10分钟;PBS缓冲液冲洗3分钟×3次。

    d) 滴加封闭用正常山羊血清工作液

    滴加100μL或适量的封闭用正常山羊血清工作液,室温孵育10~15分钟,倾去血清,勿洗。

    e) 滴加一抗

    根据组织大小,滴加100μL或适量的一抗,37℃孵育60分钟;PBS缓冲液冲洗3分钟×3次。

    f) 滴加生物素标记山羊抗小鼠/兔IgG聚合物

    滴加100μL或适量的生物素标记山羊抗小鼠/兔IgG聚合物,室温孵育10~15分钟;PBS缓冲液冲洗3分钟×3次。

    g) 滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液

    滴加100μL或适量的辣根酶标记链霉卵白素工作液,室温孵育10~15分钟;PBS缓冲液冲洗3分钟×3次。

    h) 显色

    加入适量新鲜配制的DAB或AEC显色液,室温孵育5~8分钟。

    i) 复染

    自来水冲洗,苏木素染色液孵育20秒;分化、冲洗返蓝。

    j) 脱水、透明、封片

    k) 阅片。

    4、结果判定,染色结果须由有资质的病理医生对染色后的组织片在光学显微镜下观察并进行判读。

    检验结果的解释:1、抗原修复、孵育时间、温度的修改或使用其他方法均有可能得出错误结果。

    2、在每一次染色过程中,必须有空白对照和阴性对照实验同时进行。

    3、如果阳性组织对照不能显示适当的阳性染色,应判定该批次样本的检测结果无效。

    4、若生物素标记山羊抗小鼠/兔IgG聚合物和辣根酶标记链霉卵白素工作液孵育温度过高或孵育时间过长,可能导致染色过强及背景染色。

    检验方法的局限性:1、免疫组织化学染色是一种需通过多个操作步骤完成的检测过程。在组织前期处理和实验过程中的不规范操作,有可能影响实验结果。

    2、专业的操作人员、经过认证的实验室和标准化的实验流程,可以减少各种外界因素造成的操作偏差。

    3、红细胞和细胞色素 C可能会造成假阳性结果。

    4、某些组织中内源性生物素含量比较高,可能导致染色过强及背景染色。

    5、阴性结果表示未检出抗原,不一定表示样本中无该抗原存在。待测抗原编码基因变异、抗原低表达或抗原修复不当等,都会造成抗原无法检出。

    6、本试剂仅对10%中性缓冲福尔马林固定石蜡包埋的组织进行了验证,不作其他用途。

    产品性能指标:1、装量:试剂盒各组份的溶液装量应不少于标示装量。

    2、符合性:取符合性组织片(包括阳性组织对照和阴性组织对照),经相应的免疫组化实验后,应阳性着色定位准确,且无背景染色;同时,空白对照和阴性对照染色结果为阴性。

    3、批内重复性:取同一批次的试剂盒,检测组织片3片,染色强度和定位无明显差异。

    标本染色:1. 石蜡切片,常规脱蜡至水。

    2. 如需采用抗原修复,在此步骤后进行。

    3. 3% H2O2去离子水(无色液体)孵育5~10分钟,以消除内源性过氧化物酶活性。PBS冲洗,3分钟×3次。

    4. 滴加试剂A(蓝色液体)室温孵育10~15分钟,倾去,勿洗。

    5. 滴加适当比例稀释的一抗,37℃孵育2~3小时或4℃过夜。

    6. PBS冲洗,3分钟×3次。

    7. 滴加试剂B(黄色液体)室温或37℃孵育10~15分钟。

    8. PBS冲洗,3分钟×3次。

    9. 滴加试剂C(橙色液体),室温或37℃孵育10~15分钟。

    10. PBS冲洗,3分钟×3次。

    11. 显色剂显色(DAB或AEC)。

    12. 自来水充分冲洗。

    13. 如果需要,可进行复染,脱水,透明。

    14. 选择适当的封片剂封片。


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